某些含水量低且不易變形的生物材料，可以不經(jīng)固定和干燥而在較低加速電壓下直接觀察，如動(dòng)物毛發(fā)、昆蟲(chóng)、植物種子、花粉等，但圖象質(zhì)量差，而且觀察和拍攝照片時(shí)須盡可能迅速。對(duì)大多數(shù)的生物材料，則應(yīng)首先采用化學(xué)或物理方法固定、脫水和干燥，然后噴鍍碳與金屬以提高材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額。  

 

化學(xué)方法制備樣品  

化學(xué)方法制備樣品的程序通常是：清洗、化學(xué)固定、干燥、噴鍍金屬。  

1、清洗：某些生物材料表面常附血液、細(xì)胞碎片、消化道內(nèi)的食物殘?jiān)?、?xì)菌、淋巴液及粘液等異物，掩蓋著要觀察的部位，因而，需要在固定之前用生理鹽水或等滲緩沖液等把附著物清洗干凈。亦可用5%碳酸鈉沖洗或酶消化法去除這些異物。  

2、固定：通常采用醛類(lèi)(主要是戊二醛和多聚甲醛)與四氧化鋨雙固定，也可用四氧化鋨單固定。四氧化鋨固定不僅可良好地保存組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且能增加材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，提高掃描電子顯微圖象的質(zhì)量。這對(duì)高分辨掃描電子顯微術(shù)是很重要的。為增強(qiáng)這種效果，可用四氧化鋨-單寧酸或是四氧化鋨-珠叉二胼等反復(fù)處理材料，使其結(jié)合更多的重金屬鋨，這就是導(dǎo)電染色。  

3、干燥：固定后通常采用臨界點(diǎn)干燥法。其原理是：適當(dāng)選擇溫度和壓力，使液體達(dá)到臨界狀態(tài)(液態(tài)和氣相間界面消失)，從而避免在干燥過(guò)程中由水的表面張力所造成的樣品變形。對(duì)含水生物材料直接進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥時(shí)，水的臨界溫度和壓力不能過(guò)高(37.4℃，218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脫水，再用一種中間介質(zhì)，如醋酸戊酯，置換脫水劑，然后在臨界點(diǎn)干燥器中用液體或固體二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置換劑置換中間介質(zhì)，進(jìn)行臨界干燥。  

4、噴鍍金屬：將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺(tái)上，然后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50～300埃厚的金屬膜，以提高樣品的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，改善圖象質(zhì)量，并且防止樣品受熱和輻射損傷。如果采用離子濺射鍍膜機(jī)噴鍍金屬，可獲得均勻的細(xì)顆粒薄金屬鍍層，提高掃描電子圖象的質(zhì)量。  

 

冷凍方法制備樣品  

低溫掃描電子顯微術(shù)是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術(shù)等。  

1、冷凍固定：將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成接近于生活狀態(tài)。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉(zhuǎn)移到具有低溫樣品臺(tái)的掃描電子顯微鏡中直接觀察無(wú)需進(jìn)一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡(jiǎn)便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。  

2、冷凍干燥：生物樣品經(jīng)冷凍固定后，其中的水分凍結(jié)成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品放于真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的干燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態(tài)改變。